Gracias por visitar nature.com.Está utilizando una versión de navegador con soporte limitado para CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador más actualizado (o desactive el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.Carrusel con tres diapositivas mostradas a la vez.Use los botones Anterior y Siguiente para navegar por tres diapositivas a la vez, o los botones de puntos de diapositivas al final para saltar tres diapositivas a la vez.Shuo Yang, Jennifer McAdow, … Aaron N. JohnsonTerry Lechler y Marina MapelliYongping Chai, Dong Tian, … Wei LiLaura Pirovano, Simone Culurgioni, … Marina MapelliAmrita Singh, Tanumoy Saha, … Maja MatisClare E. Buckley y Daniel St JohnstonZelin Shan, Yuting Tu, … Wenyu WenThomas Juan, Charles Géminard, … Maximilian FürthauerGhislain Gillard, Gemma Girdler y Katja RöperNature Communications volumen 13, Número de artículo: 2723 (2022) Citar este artículoLa coordinación entre la proliferación celular y la polaridad celular es crucial para orientar las divisiones celulares asimétricas para generar diversidad celular en los epitelios.En muchos casos, la vía de la polaridad de las células planas Frizzled/Dishevelled está involucrada en la orientación del huso mitótico, pero sigue sin saberse cómo se coordina espacial y temporalmente con la progresión del ciclo celular.Usando células precursoras de órganos sensoriales de Drosophila como sistema modelo, mostramos que la ciclina A, la ciclina principal que impulsa la transición a la fase M del ciclo celular, es reclutada en la corteza apical-posterior en la profase por el complejo Frizzled/Dishevelled.Esta ciclina A localizada corticalmente luego regula la orientación de la división mediante el reclutamiento de Mud, un homólogo de NuMA, la conocida proteína asociada al huso.La localización subcelular no canónica observada de la ciclina A revela que este factor mitótico es un vínculo directo entre la proliferación celular, la polaridad celular y la orientación del huso.El desarrollo y la morfogénesis de los organismos multicelulares requieren una estrecha coordinación entre la proliferación celular y la polaridad celular plana (PCP).Esto es particularmente importante durante la división celular asimétrica (ACD) de las células precursoras cuando el huso mitótico debe orientarse cuidadosamente para asegurar la segregación diferencial de los determinantes celulares polarizados a las células hijas.Esta coordinación también es importante durante la morfogénesis de los tejidos, ya que la orientación de la división celular influye en la posición de las células dentro del tejido1,2.La orientación defectuosa del huso durante el desarrollo puede conducir a una morfogénesis y organogénesis aberrantes3,4, y durante la edad adulta a la carcinogénesis5.Los mecanismos que rigen la polaridad celular, la proliferación celular y la orientación del huso mitótico ya se han descrito en profundidad, pero se sabe poco sobre cómo se coordinan estos tres procesos.PCP se refiere a la alineación de células o grupos de células dentro del plano de un epitelio, así como la orientación de la división celular en ese plano6,7,8.Esta polaridad está mediada principalmente por dos vías altamente conservadas.Un mecanismo opera a través de las cadherinas atípicas Fat (Ft) y Dachsous (Ds), y la proteína residente de Golgi de cuatro articulaciones (Fj)7.El otro mecanismo es la llamada vía core-PCP que involucra el receptor serpentino Frizzled (Fz), la proteína multidominio Disheveled (Dsh), la proteína de dominio Lim Prickle (Pk), la proteína transmembrana de cuatro pasos Van Gogh ( Vang) también llamado Estrabismo (Stbm), la proteína de repetición de anquirina Diego (Dgo) y la cadherina atípica de siete transmembrana Flamingo (Fmi) también llamada Noche estrellada (Stan).La organización de estas proteínas de la ruta core-PCP en dos complejos mutuamente excluyentes, Vang, Pk y Fmi en un polo y Fz, Dsh, Dgo y Fmi en el otro polo, produce asimetría molecular dentro de la célula y entre las células8,9, 10Tanto en vertebrados como en invertebrados, esta asimetría controla la orientación del huso mitótico en la división del epitelio11, ejemplificado aquí por la ACD de precursores de órganos sensoriales de Drosophila12,13.La ACD es un mecanismo para la diversificación de tipos de células que se observa en numerosas especies, incluidas levaduras, plantas y células animales, porque da como resultado la formación de dos células hijas con destinos distintos14,15.El proceso se puede dividir en cuatro pasos: i) adquisición de un eje de polaridad por parte de la célula madre, ii) redistribución de los determinantes del destino celular con respecto a este eje de polaridad;iii) alinear el huso mitótico con el eje de polaridad celular, y iv) segregación asimétrica de determinantes celulares en la citocinesis que induce diferentes destinos celulares en cada célula hija.En el linaje de células de cerdas de Drosophila, este proceso ocurre en divisiones sucesivas que conducen a la formación de las cuatro células diferentes que componen cada órgano mecanosensorial (o microqueto)16.Inicialmente, la célula precursora del órgano sensorial primario (SOP o pI) se divide asimétricamente dentro del plano epitelial para producir una célula precursora posterior, pIIa, y una anterior, pIIb.Luego, pIIb se divide dando lugar a una célula glial que luego muere, y una célula precursora de pIIIb, que a su vez se divide para generar las dos células internas del órgano (la neurona y las células de la vaina).Más tarde, el pIIa se divide para generar las células externas del órgano (las células del eje y del alvéolo)17,18.Entre las cuatro células precursoras, pI y pIIa se dividen a lo largo del eje anteroposterior en el plano del epitelio, mientras que pIIb y pIIIb se dividen ortogonalmente17,19.¿Cómo controla la vía Fz/Dsh la orientación del huso mitótico?Un amplio estudio de las células pI ha demostrado que el posicionamiento del huso depende de un equilibrio entre las fuerzas generadas por el complejo Fz/Dsh localizado en la corteza apical-posterior y los componentes de la vía de la proteína G heterotrimérica (HGP) ubicada en el lado opuesto de la célula. , es decir, en la corteza basal-anterior.Esto induce al huso a alinearse a lo largo del eje antero-posterior con una inclinación hacia el polo basal-anterior de las células12,20,21.Todas las fuerzas ejercidas sobre el huso son generadas por dineína, que es reclutada en cada polo del huso por Mud (Cuerpo de hongo defectuoso, NuMA en mamíferos)22.Sin embargo, Mud es reclutado diferencialmente, por los componentes HPG Pins en el polo basal-anterior y por el componente PCP Dsh en el polo apical-posterior20,21.La ciclina A (CycA) es bien conocida por su papel durante la progresión de la fase S23 y como la principal transición impulsora de la ciclina a la fase M24.El papel esencial de CycA en la entrada de la mitosis fue descrito en trabajos seminales en Drosophila que muestran que la activación de los complejos CycA/Cdk1 ocurre antes de la activación de los complejos CycB/Cdk1 durante la transición G2/M24,25, recientemente también confirmado en vertebrados26.Las distintas funciones de CycA durante las fases S y M se correlacionan con su localización intracelular.CycA está presente en el citoplasma durante la interfase y se acumula en el núcleo en la profase24, aunque esto no es un requisito previo para su función mitótica27.A partir de entonces, CycA es degradado por el Complejo Promotor de Anafase/Ciclosoma (APC/C) al entrar en la metafase28.Este papel propuesto en la mitosis se confirmó en las células del linaje de las cerdas, ya que las células progenitoras mutantes de CycA no se dividen correctamente, lo que provoca la pérdida de células y otras anomalías en los órganos mecanosensoriales terminales29.Mientras analizábamos la expresión de los factores del ciclo celular durante la ACD, sorprendentemente observamos que CycA estaba asimétricamente localizada en el polo apical-posterior durante la división de pI.Usando experimentos in vivo para seguir la dinámica de CycA y la orientación de la división celular SOP combinada con la pérdida de función (LOF) de CycA y la localización ectópica, encontramos que CycA forma una media luna cortical anclada por Fz / Dsh en el polo apical-posterior del pI células durante la transición G2/M.Proporcionamos evidencia de que la orientación del huso se controla a través de la localización de Mud dependiente de CycA en la corteza apical-posterior de las células precursoras.Discutimos la relevancia de esta localización asimétrica de CycA en la orientación de la división celular, destacando una función desconocida para este factor del ciclo celular conservado.La dinámica de la localización de CycA durante la división de las células pI de Drosophila se puede analizar en las células de las cerdas de las pupas reveladas por la expresión de la histona H2B::YFP bajo el control de P72-Gal4 (neur)13 neuralizado.Como era de esperar, la inmunotinción muestra que CycA se localiza en el citoplasma durante la fase G2 y se vuelve a localizar en el núcleo en la profase (Fig. 1a).Sorprendentemente, observamos consistentemente que CycA estaba asimétricamente enriquecida en la corteza de las células pI en la transición de fase G2/M (flechas en la Fig. 1a), formando una media luna distinta.La media luna CycA estaba en una región apical-posterior de la corteza como lo revela su colocalización con el marcador apical pTyr y el marcador apical-posterior aPKC (flechas en la Fig. 1b y c respectivamente).Para analizar la dinámica de esta localización asimétrica, generamos una cepa knock-in (CycA::eGFP) etiquetada con eGFP C-terminal mediada por CycA-CRISPR.La Figura 1d muestra seis fotogramas de una grabación típica de lapso de tiempo de la celda pI identificada en este caso por la expresión de Histone H2B::RFP.Las películas se segmentaron para distinguir entre CycA apical y basal (que se muestran en verde y rojo respectivamente en la Fig. 1d, Película complementaria 1 y en kymograph que se muestra en la Fig. 1e).En el polo apical de las células pI, CycA se agregó primero como puntas (puntas de flecha en la Fig. 1d), luego se formó la media luna CycA (flechas en la Fig. 1d), que persistió hasta el final de la profase (duración en la corteza = 22 ± 7 min, n = 38 pI células).Como se describió anteriormente, CycA también se localiza en los centrosomas30 (estrellas en la Fig. 1d, e).Luego, la CycA cortical se extendió más alrededor de la corteza celular y desapareció, mientras que el conjunto de CycA citoplasmático se volvió evanescente.Esta cinética se puede distinguir en el quimógrafo adjunto (Fig. 1e, f).La dinámica de formación, persistencia y disipación de la media luna CycA fue completamente diferente a la del marcador cortical Partner of Numb (PON::GFP, expresado en SOP bajo el control de neur)31, que estaba enriquecido en la base -polo anterior después de que se formó la media luna CycA (los dos primeros paneles en la Fig. 1a complementaria) y se mantuvo durante toda la división (último panel en la Fig. 1a complementaria).una localización intracelular de CycA.CycA endógeno revelado por inmunofluorescencia en rojo.Las células sensoriales se identifican utilizando neur > H2B::YFP (verde), que también muestra el estado condensado del ADN durante la mitosis.Tenga en cuenta que CycA forma una media luna (flechas) en la corteza posterior de la célula pI al final de la fase G2 y al comienzo de la profase.Paneles inferiores, canales de color separados que se muestran en escala de grises (n = 8).b, c Sección apical de células pI.CycA (rojo) se localiza en la región apical-posterior de la corteza (flechas) durante la mitosis pI como lo revela su colocalización (verde) con pTyr (b, n = 3) y aPKC (c, n = 4).d Instantáneas de imágenes en vivo 4D de CycA::eGFP.Los grupos de CycA quiméricos apicales y basales se separan artificialmente (CycA Ap, verde; CycA Ba, rojo) con cromosomas marcados con H2B::YFP (azul).Las puntas de flecha apuntan a la acumulación de puntos CycA en la parte apical de la célula, las flechas indican la media luna apical-posterior, las estrellas muestran los centrosomas.El tiempo se da en minutos en relación con el inicio de la metafase.e Kymograph de la celda pI que se muestra en D, construida a lo largo de una línea que pasa por el polo apical de la celda pI desde la fase G2 en adelante.Tenga en cuenta que la acumulación de puntos apical-posteriores (puntas de flecha) se produjo antes de la formación de la media luna CycA (flechas).Las estrellas indican centrosomas.f Vista esquemática de CycA (verde) durante la mitosis pI que muestra el ADN (rojo) y el huso mitótico (azul).Hormiga anterior;Publicar, posteriores;una apical;B, basales.Anterior está a la izquierda en a, b, c y f y al fondo en d y e.Barras de escala, 5 μm.Se observó una media luna apical de CycA durante la división celular pIIa identificada por la inmunorreactividad de Pdm1 (Figura complementaria 1b) y por grabación in vivo (Película complementaria 2), pero no se observó ninguna durante las divisiones pIIb y pIIIb (Figura complementaria 1c-f , y Películas complementarias 2 y 3).Dado que las células precursoras pI y pIIa se dividen dentro del plano del epitelio, mientras que las células precursoras pIIb y pIIIb se dividen ortogonalmente al plano epitelial, estas observaciones sugieren que la localización de CycA en la corteza apical-posterior es específica de las células que se dividen en el plano epitelial.Para abordar si la formación de una media luna de CycA es específica de la ACD de cerdas, seguimos la dinámica de CycA durante la división de las células epiteliales circundantes de manera similar.Durante la división de las células epiteliales, CycA se transportó entre el citoplasma y el núcleo antes de desaparecer, pero nunca observamos un enriquecimiento apical cortical de CycA o una media luna incluso en las células de la profase identificadas por la relocalización nuclear de CycA (n = 15 células; Fig. 1g complementaria y Películas complementarias 4).Para resumir, un grupo de CycA se localiza asimétricamente en la corteza apical-posterior en la transición G2/M y específicamente durante la división celular plana de las células precursoras de las cerdas.La localización cortical apical-posterior de CycA recordaba a la observada para Fz y Dsh, dos factores de PCP.Esto nos llevó a investigar si existe alguna interacción entre CycA y PCP mediante dos estrategias.En primer lugar, la inmunorreactividad de CycA, Fz y Dsh en células pI mostró que la CycA presente en la media luna posterior apical se colocalizó con Fz y Dsh (flechas, Fig. 2a).Para mejorar la resolución de las observaciones hasta 50 nm32, se utilizó microscopía de súper resolución (STED) (Fig. 2c, f, i).La cuantificación de las señales fluorescentes (Fig. 2d, g, j) reveló que casi todos los picos fluorescentes de CycA coincidieron con los picos Fz y Dsh (Fig. 2d, g; n = 4 y n = 3, respectivamente).Se obtuvieron picos de fluorescencia coincidentes similares para Fz y Dsh que ya se sabe que interactúan33 (Fig. 2j, n = 3).La estrecha colocalización entre CycA y Fz se confirmó de forma independiente mediante amplificación lineal de polimerasa (PLA)34.Para validar esta técnica, se sobreexpresó CycA:HA en células precursoras de órganos sensoriales que expresaban GFP fusionadas con la parte intracelular de la proteína Fz bajo el control del promotor de armadillo (Arm-fz::GFP)35,36 (Fig. 2a-c complementaria ).En estas condiciones, los puntos PLA correspondían a los epítopos CycA y GFP que estaban muy cerca.Los puntos PLA fueron abundantes en las células pI (9,7 ± 3,1 puntos Fz::GFP-CycA, n = 13 células) pero menos en las células de control (1,9 ± 1,2 puntos Fz::GFP-CycA, n = 15 células) (comparar Fig. 2a, b).Cuando se aplicó la técnica PLA durante la división celular pI en moscas brazo> fz :: GFP, se observaron alineaciones de puntos PLA en la corteza apical-posterior que recubre la media luna CycA (n = 4 células, flechas en la Fig. 2c complementaria) mientras que no Se detectaron puntos PLA en células pI que expresaban cadherina :: GFP como control negativo (n = 4, Fig. 2d complementaria).Para probar más si CycA interactúa con Fz y Dsh, se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación en embriones que sobreexpresan CycA::HA, Fz::GFP y Dsh::myc.CycA se inmunoprecipitó utilizando perlas recubiertas con anticuerpos anti-HA.De acuerdo con nuestros datos de colocalización, Fz y Dsh se inmunoprecipitaron con CycA, al igual que Cdk1 actuando como control positivo (estrellas, Fig. 2k, l y Fig. 3 complementaria).Fz se detectó a aproximadamente 90–95 kDa (Fig. 2k) y Dsh alrededor de 85–90 kD (Fig. 2l).una inmunofluorescencia CycA (rojo), Fz (verde) y Dsh (azul) en una célula pI de pupas de 17 h APF de edad.El enriquecimiento cortical de las tres proteínas en el polo posterior se muestra con una flecha.Canales de color separados que se muestran en escala de grises a la derecha.b–j Análisis STED de inmunodetección de CycA, Fz y Dsh.Inmunotinción de la misma célula pI después de la captura de imágenes mediante microscopía confocal (b, e, h) o STED (c, f, i).En b, e y h, los cuadrados blancos indican las áreas que se muestran en c, f e i.Se realizó una comparación por pares: (b, c) CycA (verde) y Fz (rojo), (e, f) CycA (verde) y Dsh (azul), (h, i) Fz (rojo) y Dsh (azul).( d, g, j ) Gráficos que muestran la intensidad de la inmunotinción STED (eje vertical) frente a la distancia en μm a lo largo de una línea que pasa por la media luna CycA (eje horizontal) en c, f e I, respectivamente.Tenga en cuenta que los picos fluorescentes de CycA se corresponden con los de Fz y Dsh, en la misma medida que los de Fz y Dsh.n = 6, 4, 3 y 3 en a, b, c y d, respectivamente.Anterior es a la izquierda.Barras de escala, 5 μm.Prueba de Mann-Whitney de dos colas no pareadas para ángulos αA/P y prueba de Wilcoxon para ángulos αA/B.(k, l) CycA co-inmunoprecipitados con Fz (k, n = 4) y Dsh (l, n = 3).Las proteínas inmunoprecipitadas utilizando perlas anti-HA se obtuvieron de embriones que expresaban CycA::HA, Fz::GFP y Dsh::myc o, como controles negativos, de embriones que expresaban solo Fz::GFP y Dsh::myc o w1118.Fz y Dsh se detectaron usando anticuerpos anti-GFP y anti-myc respectivamente.La detección de Cdk1 se utilizó como control positivo.Para cada transferencia y para cada anticuerpo, se adaptó el tiempo de exposición para obtener una señal óptima.Los asteriscos indican la proteína inmunoprecipitada específica y (ns) las proteínas no específicas retenidas.Tenga en cuenta que Dsh::myc se expresó menos en la entrada de embriones que expresan solo Fz::GFP y Dsh::myc.Para demostrar inequívocamente que la banda co-inmunoprecipitada correspondiente a Dsh::myc es específica, en la Fig. 3 complementaria se muestra una transferencia más expuesta y el resultado de otro experimento independiente. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.En segundo lugar, dado que el complejo PCP posterior apical está compuesto por Fz, Dsh y Dgo, determinamos si la formación de la media luna de CycA dependía de Fz, Dsh y Dgo analizando la localización de CycA en los contextos LOF de fz, dsh y dgo.Se detectó una media luna CycA posterior en el 95 % de las profases pI de control (Fig. 3a, n = 20), y también en el 93 % de las células pI mutantes dgo308/dgo380 usando inmunotinción CycA (Fig. 4a complementaria) o CycA :: eGFP línea de vuelo (Película complementaria 5, n = 40).Como se esperaba en dgo LOF, la PCP está alterada y la media luna de CycA no está estrictamente orientada hacia el polo posterior de las células pI (Figura complementaria 4b y Película complementaria 6).Por el contrario, la media luna CycA no se detectó o se detectó muy débilmente (respectivamente 75 y 25% de las profases pI analizadas) en la corteza apical-posterior de las células mutantes fzK21/KD4 (Fig. 3b, n = 14).Se realizaron observaciones similares en células pI mutantes dsh1 (una mutación dsh de sentido erróneo que anula solo su actividad PCP37), usando inmunotinción CycA (Fig. 3c, n = 10) o la línea de mosca CycA::eGFP (Fig. 3d, e y complementario Película 7, n = 16).Estos datos sugieren que Fz y Dsh, pero no Dgo, son necesarios para localizar CycA en la corteza apical-posterior.Además, no pudimos observar una diferencia en la tinción de CycA en las condiciones mutantes fzK21 / KD4 o dsh1 (comparar Fig. 3b, c).Sin embargo, observamos que Fz estaba ubicado uniformemente en toda la corteza apical en células pI mutantes dsh1, lo que confirma las observaciones publicadas anteriormente (Fig. 5 complementaria, Películas complementarias 8 y 9, también mostradas en 38).Como tal, dado que CycA no siguió la localización de Fz en mutantes dsh1, podemos concluir que se requiere Dsh para reclutar CycA en el polo apical posterior de las células pI.Llevando esto un paso más allá, nos preguntamos si la deslocalización ectópica de Fz cortical deslocalizaría CycA también.Con este fin, sobreexpresamos un reportero Fz etiquetado con myc en células pI y analizamos la localización de CycA resultante mediante inmunomarcaje.En contraste con el control, la tinción de Fz, Dsh y significativamente CycA ya no se restringieron al polo posterior de las células pI (Fig. 3f, g, flecha blanca), sino que se extendieron alrededor de la célula pI lateralmente (Fig. 3f , flechas amarillas, n = 8) o alrededor de la corteza apical (Fig. 3g, n = 2).Este resultado indica que Fz, mediada por Dsh, ancla CycA a la localización apical-posterior en células pI.Localización de CycA en control (a, d), mutante fz (B) y mutante dsh (c, e).Inmunorreactividad de CycA (rojo) en células de profase pI identificadas por inmunotinción de corte (azul) en pupas de control (a), fzK21/KD4 (b) y dsh1 (c) 17 h APF.Todas las células pI se encuentran en la misma etapa que revela la inmunotinción de γ-tubulina (verde).Tenga en cuenta que el enriquecimiento apical-posterior de CycA (flecha en el control, a) no se observa en fzK21/KD4 (b) o dsh1 (c).(d, e) dinámica in vivo de CycA::eGFP (verde) en control (d) y dsh1 (e) pupas que expresan H2B::RFP (rojo) bajo el control de neur para identificar células pI.( f, g ) Localización cortical de CycA después de la sobreexpresión de fz.CycA (verde), Fz (rojo) y Dsh (azul) inmunotinción en células pI 17 h APF que expresan una forma myc-tagged-Fz.La flecha blanca apunta a la media luna apical-posterior de CycA, mientras que las flechas amarillas indican una extensión del reclutamiento cortical de CycA.n = 20, 14, 10, 20, 16, 8 y 2 en a, b, c, d, e, f y g, respectivamente.Anterior es a la izquierda.Barra de escala, 5 μm.Durante la división de las células precursoras pI y pIIa, la orientación del huso se orienta a lo largo de la anteroposterior y se inclina hacia el polo basal-anterior por los complejos Fz/Dsh y HPG12,13,21.Asumiendo que CycA es reclutado por el complejo Fz/Dsh, investigamos si CycA tiene un papel en el posicionamiento del huso mitótico.El LOF completo de CycA induce una detención drástica del ciclo celular, por lo que configuramos condiciones LOF más suaves, ya sea utilizando la combinación trans-heterocigota de CycAC8LR1/hari o una línea CycARNAi (ver Métodos).Las moscas con cualquiera de estos genotipos LOF eran viables con defectos sensoriales leves en las cerdas29,39 (Fig. 6a-c complementaria).En ambos contextos, la orientación del huso se controló mediante imágenes en vivo utilizando la expresión de PON::GFP y His::RFP para evaluar la asimetría de la división y etiquetar los cromosomas.El posicionamiento del huso mitótico en relación tanto con el eje anteroposterior como con el plano del epitelio se controló midiendo los ángulos (siempre dados en grados) entre un vector que apunta hacia la media luna PON que une los centros de ambos núcleos hijos en el transición de metafase/anafase en relación con la línea media de la pupa (αA/P) y el plano del epitelio (αA/B) respectivamente (se muestra para las células pI en la Fig. 4a–f).En las células CycARNAi pI, la orientación de los husos en relación con el eje anteroposterior estaba ligeramente sesgada hacia la línea media (30,8 ± 2,9 en CycARNAi (n = 74) en comparación con 19,1 ± 2,4 en el control (n = 67), p = 0,0012 ) (Figura 4g).En CycAC8LR1/hari no hubo una marcada diferencia en la orientación de la división con respecto al eje anteroposterior (21,1 ± 3,4 (n = 64); frente a 25,4 ± 2,2 en las células de control (n = 91); p = 0,27) ( figura 4g).Por el contrario, la orientación del huso en relación con el plano epitelial estaba claramente alterada en ambos contextos CycA LOF (19,0 ± 1,3 en CycAC8LR1/hari (n = 60) en comparación con 12,7 ± 1,0 en células pI de control (n = 84), p = 0,0006 y 20,6 ± 1,8 en CycARNAi (n = 59 células) y 12,1 ± 1,1 en células control pI (n = 63), p = 0,00043) (Fig. 4h).Es poco probable que estas desorientaciones del huso se deban a la disminución de la actividad mitótica de CycA, ya que no hubo relación entre la duración de la mitosis y el ángulo αA/B (Fig. 4i, J).Por lo tanto, en las mitosis CycA LOF pI, el huso se desvía hacia la línea media a lo largo del eje anteroposterior y más inclinado hacia el polo basal.La discrepancia observada entre las dos condiciones refleja un efecto LOF más leve en CycAC8LR1/hari, como lo demuestra la débil acumulación apical-posterior de CycA observada en este contexto, mientras que no se observó acumulación apical-posterior de CycA en células CycARNAi pI (compárese con la tinción de CycA en Figura complementaria 6d, e).Estas condiciones que afectan la orientación del huso en las células pI sin alterar la mitosis (misma duración de la mitosis que va de 9 a 21 min (Fig. 4i, j) y sin retraso en la entrada en la mitosis tanto en los fondos mutantes de CycA como en el control) fueron el más fuerte que obtuvimos.Razonamos que la fuerza de CycA LOF podría estar correlacionada con la duración de la fase G2 (más de 6 h) que precede a la mitosis pI40.Así, analizamos la orientación de los husos en células pIIa, que también se dividen en el plano epitelial y donde la fase G2 dura solo 1 h41.La orientación de los husos en relación con el eje anteroposterior sí se vio afectada en las células CycAC8LR1/hari pIIa (0,5 ± 8,3 (n = 57) en comparación con 25,2 ± 2 en las células de control (n = 128), p = 0,00046) ( Figura complementaria 7a).La orientación del huso en relación con el plano epitelial también se alteró en las células CycAC8LR1/hari pIIa (30,1 ± 2,5 (n = 36) en comparación con 12,5 ± 0,7 en las células de control (n = 84) p < 0,001) (Fig. 7b complementaria ).Aunque la duración de la mitosis aumentó ligeramente en CycAC8LR1/hari (variando de 12 a 24 min (n = 47) en comparación con 9 a 15 min en el control (n = 57)), no hubo relación entre la duración de la mitosis y el αA/B. se observó el ángulo (Fig. 7c complementaria).Desafortunadamente, no podemos analizar CycARNAi LOF de la misma manera.De hecho, las mitosis de pIIa se vieron afectadas en estas condiciones, lo que refleja la correlación entre el fenotipo y la duración de la fase G2.A partir de estos datos, concluimos que en las divisiones planares CycA LOF, el huso está mal orientado a lo largo del eje anteroposterior y más inclinado hacia el polo basal.a–f Ángulos del huso mitótico con respecto al eje anteroposterior (αA/P, a–c) y al eje apico-basal (αA/B, d–f).Diagrama esquemático (a, d) y ejemplos representativos de los ángulos αA/P y αA/B en control (b, e) y en CycAC8LR1/hari (c, f).En b, c, eyf, PON::GFP (verde) e Histona H2B::RFP (roja) revelan la polaridad anteroposterior y el ADN, respectivamente.Los ángulos αA/P se miden en relación con la línea media de la pupa (líneas discontinuas en a, b y c).Las flechas azules indican la orientación del eje en relación con el marcador PON::GFP basal-anterior.(g, h) Gráficos acumulativos de αA/P (g) y de αA/B (h) en control (n = 91 y n = 67 en g y n = 84 y n = 63 en h), CycAC8LR1/hari ( n = 64 en g y n = 60 en h) y CycARNAi (n = 74 en g y n = 59 en h).El eje horizontal representa el ángulo entre el eje de división y la línea media en g o el plano epitelial en h y el eje vertical el % acumulado de células.A lo largo del eje anteroposterior, los ángulos medidos son positivos cuando el polo anterior del huso está más cerca de la línea media que el polo posterior del huso.A lo largo del eje apico-basal, los ángulos medidos son positivos cuando el polo anterior del huso es más basal que el polo posterior del huso.Tenga en cuenta que en CycA LOF, el eje estaba más inclinado en relación con el plano del epitelio.La significación se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas no pareadas para ángulos αA/P y mediante una prueba de Wilcoxon para ángulos αA/B.(i, j) Relación entre la duración de la mitosis y los ángulos αA/B en control (n = 51 en i y n = 64 en j), CycAC8LR1/hari (n = 48, i) y CycARNAi (n = 56, j ) células pI.Tenga en cuenta que para cada duración de la mitosis, la distribución de ángulos fue similar en control y CycA LOF.Barras de escala, 5 μm.Anterior es a la izquierda.Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.Para estudiar si CycA LOF afectó la asimetría de las células pI, monitoreamos la localización de los determinantes del destino celular en células mutantes CycA pI mediante el análisis de PON :: GFP y aPKC (Fig. 6f-h complementaria).La localización asimétrica canónica de estos marcadores se conserva con acumulación de PON-GFP en el polo anterior basal y aPKC en el polo posterior apical.En células CycA LOF pI antes del inicio de la mitosis, la localización de ambos marcadores fue similar a la observada en condiciones de control, lo que indica que los determinantes del destino celular se distribuyen normalmente cuando se pierde la función de CycA aunque el huso esté mal orientado.Por lo tanto, CycA controla la orientación del huso en las células pI a lo largo del eje anteroposterior y lo mantiene en el plano epitelial de las células.A continuación, evaluamos la contribución de CycA cortical al control de la orientación del huso.Con este fin, probamos el efecto sobre la orientación del huso del anclaje ectópico de CycA en la corteza de las células pI.Se generaron dos formas de CycA para localizar CycA en la corteza basal-anterior usando el dominio de localización PON31 (PON-CA; Fig. 5a, b) o dentro de toda la corteza usando el dominio de localización de la fosfolipasa C42 (PH-CA; Fig. 5c).No observamos diferencias en la orientación de las divisiones a lo largo del eje apico-basal después de la sobreexpresión de PON-CA (11,1 ± 1,3 n = 70) o expresión de PH-CA (11,4 ± 0,8, n = 80) en comparación con 12,7 ± 1,0 en el control (n = 84; p = 0,45 para PON-CA, p = 0,117 para PH-CA) (Fig. 5e).A lo largo del eje anteroposterior, la orientación de las divisiones tendió a desplazarse hacia la línea media (Fig. 5d; 32,8 ± 3,8 en PON-CA (n = 76) y 31,8 ± 3,1 en PH-CA (n = 80) en comparación a 25,4 ± 2,2 en el control (n = 91; p = 0,097 y p = 0,109 respectivamente).Es importante señalar que estos efectos fueron similares a los observados en CycA leve LOF (p = 0,67 y p = 0,80 para PON- CA y PH-CA, respectivamente). Una vez más, los efectos fueron independientes de la progresión a través de la mitosis, ya que no se observó correlación entre la orientación del huso y la duración de la mitosis cuando se expresaron PON-CA o PH-CA (Fig. 8a complementaria , b).Por lo tanto, nuestros datos indican que la orientación del huso mitótico depende de un equilibrio sutil entre el anclaje y/o las fuerzas generadas en los dos polos del huso, con cambios en la ubicación y/o cantidad de CycA en la corteza que perturban el equilibrio, perjudicando así la orientación del husillo.a–c Localización intracelular de CycA (rojo) durante la mitosis de pI en células de control (a) y en células con CycA ectópica localizada en la corteza anterior basal (b, PON-CA) o a través de toda la corteza (c, PH- CA) de pupas que expresan PON::GFP (verde) e histona H2B::RFP (azul) para revelar la polaridad anteroposterior y el ADN, respectivamente.Anterior a la izquierda.d-g Gráficas acumulativas de los ángulos del huso mitótico en relación con el eje anteroposterior (αA/P) en el control (n = 91), PON-CA (n = 76), PH-CA (n = 80) (d) , CycAC8lR1/+ (n = 80), y células PON-CA;CycAC8lR1/+ pI (n = 60) (f), y en relación con el plano del epitelio (αA/B) en el control (n = 84), PON-CA (n = 81), PH-CA (n = 80) (e), CycAC8lR1/+ (n = 78) y PON-CA;CycAC8lR1/+ (n = 51) células pI (g).Tenga en cuenta la deriva significativa en la orientación del huso después de la localización cortical ectópica de CycA en un contexto heterocigoto de CycA.h–j Localización intracelular de CycA (rojo) durante la mitosis pIIb en el control (h), así como en pupas que expresan PON-CA (i) o PH-CA (j) con PON::GFP (verde) e Histona H2B ::RFP (azul).Anterior a la izquierda.k, l Gráfica acumulativa de ángulos pIIb αA/B de husos mitóticos en control (n = 114), PON-CA (n = 93), PH-CA (n = 77) pupas (k) y en CycAC8lR1/+ (n = 42) y PON-CA;CycAC8lR1/+ (n = 65) pupas (l).Tenga en cuenta que CycA modificó la orientación del huso durante la mitosis pIIb dependiendo de su localización cortical, y que este efecto es independiente de la cantidad total de CycA.Barras de escala, 5 μm.La significación se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas no pareadas para ángulos αA/P y mediante una prueba de Wilcoxon para ángulos αA/B.Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.Razonamos que si el grupo cortical apical-posterior endógeno de CycA contribuye al anclaje posterior y/oa las fuerzas, debe haber estado contrarrestando los efectos de PON-CA en estos experimentos.Para probar esta posibilidad, expresamos PON-CA en un fondo heterocigoto CycA (CycAC8LR1 / +) y medimos la orientación del huso durante la división celular pI como anteriormente (Fig. 5f, g).Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.Los datos de origen se proporcionan con este documento.actualBiol.actualBiol.J. ciencia celular.Genes Dev.añoRev. Célula Desv.Biol.BioquímicaSoc.Trans.Semin.Desarrollo celularBiol.Nat.Biol celular.J. Dev.Biol.Wiley Interdiscip.Rev. Dev.Biol.Nat.Biol celular.desarrolloNat.Biol celular.Tendencias Cell Biol.actualBiol.desarrolloactualBiol.proc.Academia Nacional.cienciamol.Nat.Nat.Biol celular.desarrolloBiol.mol.desarrolloGenes Evol.desarrolloBiol.actualOpiniónBiol celular.actualCima.desarrolloBiol.mecánicodesarrolloComun de celularSeñal.mol.Biol.PLoS Genet.J. ciencia celular.PLoS Genet.Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.Los autores declaran no tener conflictos de intereses.Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material.Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt